Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Orfāno ar G-proteīnu saistīto receptoru, peptīdu dabas ligandu skrīnēšanas sistēmas izstrāde

 

 

Projekta nosaukums: „ Orfāno ar G-proteīnu saistīto receptoru, peptīdu dabas ligandu skrīnēšanas sistēmas izstrāde”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma "Praktiskas ievirzes pētījumi" 1. kārtas ietvaros. 

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/16/A/055

Projekta izpildes termiņš: 2017. gada 1. janvāris - 2019. gada 31. decembris

Projekta kopējais finansējums: 285 245,84 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. D. Fridmanis

 

Ar G-proteīnu saistītie receptori (GPCR) ir lielākā membrānas receptoru saime. To galvenā funkcija ir signālu pārnese cauri membrānai. Visi GPCR-i sastāv no septiņiem transmembrānas domēniem un, sasitot ligandus, aktivē heterotrimeros G proteīnus. Tie ir vieni no visrūpīgāk pētītajiem medikamentu mērķiem

farmācijas industrijā un 36% no tirgū pieejamajiem medikamentiem iedarbojas, saistoties ar tiem. Tomēr vairāk nekā 90 cilvēka GPCRu vēl arvien nav noskaidrots dabīgais ligands, tādeļ tos dēvē par orfāniem receptoriem. Daudziem no tiem farmakoloģiskā nozīme tika izvērtēta peļu modeļos, pielietojot gēna

izslēgšanu un tika secināts, ka orfānie receptori ir būtiski organisma darbības regulācijā, un, to ligandu atrašana varētu radīt jaunus medikamentus. Par farmācijas industrijai nozīmīgiem var tikt uzskatīti arī daudzi komerciāli audzēto organismu orfānie receptori. Tādeļ arī to ligandu atklāšana būtu ekonomiski pamatota un izdevīga. Daļā gadījumu šie citu sugu ligandi varētu būt funkcionāli aktīvi arī zīdītājos un varētu kalpot par bāzi jaunu medikamentu izstrādē.

Šī projekta mērķis ir izstrādāt vienkāršu un efektīvu uz rauga S.cerevisiae balstītu peptīdu dabas GPCR ligandu atklāšanas sistēmas prototipu, ka arī pārbaudīt to praksē, nosakot ascidijas oreksina receptoram līdzīga receptora ligandu un izvērtējot jaunatklātā liganda ietekmi uz cilvēka Oreksina receptoriem.

Šī pētniecības projekta realizācija sniegs ieguldījumu Latvijas viedas specializācijas stratēģijas noteiktās jomās – biofarmācijā un biotehnoloģijas attīstība, jo izstrādājamajam prototipam piemīt potenciāls veicināt jaunu preparātu izstrādi tādejādi, sniedzot ieguldījumu Latvijas farmācijas industrijas attīstībā, un attiecīgi, uzlabojot Latvijas tautsaimniecības konkurētspēju.

Informācija publicēta: 02.01.2017.

 

Projekta progress

2017. gada 1. janvāris - 2017. gada 31. marts

Eksperimentālā izstrāde

Saskaņā ar plānu, projekta izpildes pirmie trīs mēneši tika veltīti dubultās ekspresijas plazmīdas izveidei. Tā kā mūsu rīcībā esošās ekspresijas plazmīdas: p426GPD un p426TEF bija faktiski identiskas tad, šo darbu ietvaros, ar mērķi padarīt ekspresijas lokusu multiklonālos rajonus atšķirīgus un savstarpēji savietojamus, tie tika modificēti tā, lai katrs saturētu tikai divus – klonēšanai nepieciešamus restrikcijas saitus. Tālākajā darbu gaitā, pēc iegūto plazmīdu sekvences atbilstības pārbaudes, TEF promoteru saturošais lokus no p426TEF plazmīdas tika pārklonēts uz p426GPD plazmīdu. Uz doto brīdi norit darbi pie iegūtās konstrukcijas sekvences atbilstības pārbaudes.

Informācija publicēta: 31.03.2017.


Projekta progress

2017. gada 1. aprīlis - 2017. gada 30. jūnijs

Eksperimentālā izstrāde

Šajā projekta posmā TEF promoteru saturošās plazmīdas gēna ekspresijai nozīmīgais funkcionālais rajons tika pārcelts uz GDP promoteru saturošo plazmīdu un iegūtajā dubultās ekpresijas plazmīdā tika ievietoti attiecīgi MC4R un a-MSH kodēšošie gēni. Pēc šīs plazmīdu ieguves tajā ievietotās kodējošās sekvences tika nosekvencētas, lai pārliecinātos par iegūtā rezultāta atbilstību plānotajam. Turpmākajā darba gaitā tika uzsākti darbi, kas ietvēra iegūtās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālo pārbaudi.

Informācija publicēta: 30.06.2017.

 

Projekta progress

2017. gada 1. jūlijs - 2017. gada 30. septembris

Eksperimentālā izstrāde

Šajā projekta posmā tika uzsākti darbi pie iepriekš izveidotās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālo pārbaudi. To ietvaros izveidotā plazmīda un kontroles plazmīdas tika ietransformētas humanizētā S.cerevisiae rauga celma MMY28 šūnās, kas savukārt tika izsētas uz selektīvās barotnes saturošām petri platēm, kas atsevišķos gadījumos bija papildinātas ar MC4R ligandu - a-MSH. Iegūtie rezultāti nebija viennozīmīgi tādēļ nākamajos posmos tiks atkārtoti.

Informācija publicēta: 29.09.2017.

 

Projekta progress

2017. gada 1. oktobris - 2017. gada 31. decembris

Eksperimentālā izstrāde

Šajā projekta posmā tika turpināti darbi pie iepriekš izveidotās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālās pārbaudes. To ietvaros attiecīgās plazmīdas tika atkārtoti transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās, kas tālāk tika izsētas uz selektīvu barotni saturošām petri-platēm, kuru sastāvs atsevišķos gadījumos tika papildinātas ar a-MSH. Tā kā iegūtie rezultāti atkārtoti bija neviennozīmīgi, tad tika nolemts plazmīdas darbību pārbaudīt Western-Blot metodes ietvaros pielietojot a‑MSH specifisku antivielu. Paralēli, lai nekavētu projekta izpildi, tika izstrādāts eksperimentu plāns, kura ietvaros divas atsevišķas ekspresijas plazmīdas tiks secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās.

Informācija publicēta: 02.01.2018.

 

Projekta progress:

2018. gada 1. janvāris - 2018. gada 31. marts

 Eksperimentālā izstrāde

Šajā projekta posmā Eksperimentālās izstrādes aktivitātes ietvaros tika veikti eksperimenti kuru ietvaros ar Western-Blot metodes palīdzību pielietojot a-MSH specifisku antivielu tika novērtēta iepriekš izstrādāto plazmīdu darbība. Iegūtie rezultāti apstiprināja, ka eksperimentu gaitā a-MSH tiek ekspresēts, tomēr, ņemot vērā vājo signālu, tā sekrēcijas apjoms varētu nebūt pietiekams, lai efektīvi aktivētu līdz-ekspresēto MC4R, kas arī izskaidro iepriekš iegūtos – neviennozīmīgos rezultātus. Lai rastu risinājumu šai problēmai, tika veikta padziļināta literatūras analīze. Tās rezultātā tika secināts, ka starp sekretējamo peptīdu un sekrēcijas signālu ir nepieciešams ievietot savienotājpeptīdu. Uz doto brīdi ir uzsākta savienotājpeptīda ievietošanas procesa izstrāde. Paralēli šīm darbībām tika veikts eksperiments, kura ietvaros divas atsevišķas ekspresijas plazmīdas tika secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās un audzētas vidē bez histidīna, tādejādi pieļaujot tikai to šūnu augšanu, kuru ekspresētais receptors tiek aktivēts. Iegūtie rezultāti viesa cerības, jo šūnas, kas saturēja abas plazmīdas auga nedaudz straujāk, kā tās kas saturēja tikai vienu.

Sistēmas validācija

Tā kā aktivitātes “Eksperimentālā izstrāde” ietvaros iegūtie rezultāti norādīja, ka izstrādātā eksperimentālā sistēma varētu stādāt, tad šīs aktivitātes ietvaros tika veikti pirmie eksperimenti, kas apstiprinātu šo pieņēmumu. Šo eksperimentu ietvaros tika sagatavota plazmīda, kurai a-MSH sekvences vietā atradās randomizēts peptīdu kodējošā sekvence. Tālākajā gaitā iegūtā plazmīda līdz ar MC4R saturošo plazīdu tika tika secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās, vairākas dienas audzētas vidē bez histidīna un izdalītas no rauga šūnām. Iegūtās plazmīdas, kā arī randomizētās izejas plazmīdas randomizētais rajons tika sekvencētas pielietojot IonTorrent PGM sekvencēšanas iekārtu un iegūtie rezultāti parādīja, ka randomizācijas nevis ataudzēšanas procesā ir notikusi selektīva a-MSH saturoši klonu atlase. Tādēļ turpmākajos projekta posmos “Eksperimentālās izstrādes” aktivitātes ietvaros tiks uzlabots randomizācijas process.

Informācija publicēta: 29.03.2018.

 

Projekta progress:

2018. gada 1. aprīlis – 2018. gada 30. jūnijs

Eksperimentālā izstrāde

Šajā projekta posmā aktivitātes ietvaros tika sagatavota ekspresijas plazmīda kurā starp sekretējamo peptīdu un sekrēcijas signālu ir ievietots savienotājpeptīds. Turpmākajos projekta posmos tiks veikti izmēģinājuma eksperimenti, lai novērtētu jaunizveidotās plazmīdas darbības efektivitāti. Paralēli šim darbam tika arī izstrādāta jauna mērķa rajona randomizācijas stratēģija, kuras rezultātā a-MSH sekvences vietā tiks ievietota randomizētu peptīdu kodējošā sekvence, kā arī tika uzsākti pirmie tās efektivitātes izvērtēšanas eksperimenti.

Sistēmas Validācija

Lai arī iepriekšējie sistēmas validācijas eksperimenti uzrādīja uz reandomizācijas procesa trūkumiem to rezultātā tika arī iegūti samērā plaši dati. Tādēļ šajā projekta posmā sistēmas validācijas aktivitātes ietvaros tika īstenota padziļināta to analīze un iegūtie rezultāti uzrādīja, ka datos, kas iegūti pēc audzēšanas, melanokortīnu receptoru farmakoforu saturošās sekvences bija sastopamas nedaudz biežāk kā datos, kas iegūti no randomizētās plazmīdas. Tādejādi norādot, ka arī pie šādas – suboptimālas randomizācijas sistēma darbojas un notiek funkcionālo klonu atlase.

Informācija publicēta 29.06.2018.




Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".