Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Ribes ģints augu, Cecidophyopsis pumpurērču un upeņu reversijas vīrusa izpēte ilgtspējīgai Ribes ģints ogulāju rezistences selekcijai un audzēšanai

 

 

Projekta nosaukums:Ribes ģints augu, Cecidophyopsis pumpurērču un upeņu reversijas vīrusa izpēte ilgtspējīgai Ribes ģints ogulāju rezistences selekcijai un audzēšanai”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma "Praktiskas ievirzes pētījumi" 2. kārtas ietvaros.

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/18/A/026

Projekta izpildes termiņš: 2019. gada 1. marts – 2022. gada 28. februāris

Projekta kopējais finansējums: 522 994,99 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Ph.D. Inga Moročko-Bičevska (Dārzkopības institūts)

Projekta partneris: Dr. biol. Ina Baļķe (Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs)

 

Projekta kopsavilkums:

Jāņogu ģints Ribes augu audzēšanu būtiski ietekmē Cecidophyopsis ērces un upeņu reversijas vīruss (BRV). Selekcijas programmas koncentrējas tikai uz C. ribis un diviem rezistences gēniem. Pētījumi parāda, ka arī citas Cecidophyopsis sugas ir plaši izplatītas, tā izskaidrojot atklātās saimniekaugu rezistences pretrunas.

Projekta mērķis ir skaidrot Cecidophyopsis-BRV kompleksa mijiedarbību ar Ribes augiem: 1) izpētot Cecidophyopsis sugu koncepciju un ģenētisko daudzveidību; 2) nosakot Cecidophyopsis sugu lomu BRV pārnesē; 3) raksturojot rezistences reakcijas uz Cecidophyopsis un BRV, izmantojot NGS gēnu ekspresijas un transkriptu analīzē; 4) izvērtējot un inventarizējot vietējo Ribes genofondu. Iegūtās zināšanas, izvērtētais vietējais genofonds un vietējo genotipu vīrusbrīvā in vitro kolekcija kalpos par bāzi ilgtspējīgai Ribes augu rezistences selekcijai un audzēšanai, sekmējot uz zināšanām balstītu bioekonomiku.

Projekta īstenošana sniegs jaunas zināšanas ilgtspējīgai Ribes augu rezistences selekcijai un audzēšanai, reizē palielinot zinātnisko publikāciju skaitu starptautiski recenzētos žurnālos un attīstot zinātnisko kapacitāti lauksaimniecībā un biotehnoloģijā. Izpildītāji ir valsts pētniecības institūti, kas garantē rezultātu publisku pieejamību (zinātniskās publikācijas, ziņojumi zinātniskās konferencēs) un zināšanu izplatīšanu nozarei (populārzinātniskās publikācijas, prezentācijas semināros, informācija publiskās datubāzēs). Projekts nodrošinās turpinājumu iesāktiem pētījumiem par Cecidophyopsis ērcēm un BRV, un, sadarbojoties abām institūcijām, uzsāktos progresīvos pētījumus augu ģenētikā, patoloģijā, molekulārajā bioloģijā un vides paraugu metagenomiskajā analīzē, nodrošinot pamatu recenzēto publikāciju sagatavošanai.

Informācija publicēta 01.03.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. marts - 2019. gada 31. maijs

Pētījumu īstenošana

Pārskata perioda laikā Darbības Nr.1 ietvaros noorganizētas piecas ekspedīcijas un ievākti paraugi pētījumiem Latvijā, Polijā, Lietuvā, Somijā, kopumā ievācot 134 Ribes augu paraugus.

Veikta mikroskopija un ērču klātbūtnes pārbaude pumpuros un sagatavoti paraugi DNS izdalīšanai. Veikta metodes izstrāde DNS parauga iegūšanai no viena ērces indivīda, kopumā analīzēm sagatavojot 919 pumpurērču DNS paraugus. Veikts darbs pie ITS reģiona amplifikācijas praimeru specifiskuma uzlabošanas, izstrādājot un testējot jaunizveidoto praimeru pārus. Uzsākta dažādu mikroskopijas veidu praktiska testēšana ērču paraugu nedestruktīvai analīzei un sugu noteikšanai, un tālākai DNS un RNS izdalīšanai no viena ērces indivīda. Uzsākta informācijas un pieejamo protokolu izpēte piemērotākās metodes izvēlei vīrusa RNS izdalīšanai no viena ērces indivīda.

Darbības Nr.2 ietvaros veikta publicētās informācijas atjaunināšana par Ribes augu rezistenci pret Cecidophyopsis sugām, zinātniskās literatūras analīze. Apkopota un analizēta informācija par iepriekšējos pētījumos analizētajiem Ribes augu paraugiem, Ce gēna genotipēšanas rezultātiem. Novērtēta DI esošā Ribes augu DNS kolekcija, tajā pieejamie paraugi, to raksturošanas pakāpe, uzsākta paraugu DNS kvantitātes un kvalitātes novērtēšana. Novērtēta DI esošā Ribes augu materiāla kolekcija DNS izdalīšanai.

Veikta padziļināta literatūras izpēte augstas kvalitātes kopējās RNS izdalīšanai no augu materiāla ar augstu polifenolu, polisaharīdu un antioksidantu saturu. Apkopotas izmantotās metodes. Izveidots protokola plāns kopējās RNS izdalīšanas metožu pārbaudei, piemērotākās identifikācijai. Veikta BMC pieejamo NGS sekvenēšanas platformu (Ion Torrent, Illumina un MGI) salīdzināšana. Ierīkots invadēšanas izmēģinājums NGS pētījumu vajadzībām uz podos audzētām āra apstākļos upenēm, jāņogām, vērenēm, invadējot tās ar trīs dažādām ērču sugām. Veikta invadēto paraugu pārbaude uz ērču bojājumiem un ievākti paraugi BRV diagnostikai pirms invadēšanas, lai izslēgtu iespējamo augu inficēšanos pirms invadēšanas. Ievākti un sagatavoti eksperimentālie Ribes augu paraugi no invadētajiem augiem RNS izdalīšanas metodikas optimizācijai, sagatavošanai NGS analīzēm.

Uzsākta sākotnēja vietējā genofonda izvērtēšana, apkopojot datus par agrākiem izvērtēšanas rezultātiem Ribes augu izturībā pret Cecidophyopsis ērcēm Dārzkopības institūta (DI) kolekciju stādījumos un izmēģinājumos. Apkopota esošā Ribes ģenētisko resursu fenotipiskās raksturošanas informācija, veikta datu statistiskā analīze. Sagatavots publikācijas manuskripts "Phenotypical variability and diversity within Ribes genetic resources collection of Latvia" un iesniegts publicēšanai Acta Horticulturae. Balstoties uz esošo informāciju par Ribes ģenētisko resursu fenotipisko raksturošanu, sagatavots mutisks ziņojums "XII International Rubus and Ribes Symposium: Innovative Rubus and Ribes Production for High Quality Berries in Changing Environments", 2019.gada 25.-28. jūnijā, Cīrihē. Uzsākta vietējās izcelsmes Ribes ģenētisko resursu kolekciju materiāla inventarizācija DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē, kā arī līdz šim ievākto datu inventarizācija, lai varētu izvērtēt, kādi papildus novērojumi un datu uzskaite būtu nepieciešami, lai atlasītu genotipus iekļaušanai nacionālajā ģenētisko resursu saglabāšanas datu bāzē un starptautiskajās datubāzēs.

Uzsākta līdz šim pilnvērtīgi neizvērtēto genofonda kolekcijās saglabāto un agrākajās genofonda ekspedīcijās ievākto vietējo Ribes genotipu izvērtēšana lauka kolekcijās. Vērtēšana veikta pēc RIBESCO deskriptoriem. Kopā uzsākta 23 ērkšķogu, 23 upeņu un 12 jāņogu genotipu vērtēšana.

Izveidots rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo genotipu saraksts pavairošanai in vitro un uzsākta šo augu ievadīšana in vitro, kā arī uzsākta vērtīgāko vietējās izcelsmes genotipu ievadīšana audu kultūrā atveseļošanai un tālākai saglabāšanai, veidojot atveseļotu, vīrusbrīvu kolekciju.

Informācija publicēta 31.05.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. jūnijs - 2019. gada 31. augusts

Darbības Nr.2 ietvaros veikta trīs Ribes ģints augu (upenes, vērenes, jāņogas) paraugu ievākšana un uzglabāšana pie dažādām temperatūrām (+4°C, -20°C, -80°C) ar un bez RNAlater, ar mērķi noteikt efektīvākos paraugu uzglabāšanas apstākļus, kas ļautu izdalīt kvalitatīvu kopējo RNS NGS analīzei. Pie +4°C uzglabātie paraugi ar un bez RNAlater tika izmantoti RNS izdalīšanai ar TRI Reagent, taču pēc RNS paraugu analīzes tika konstatēts, ka šī metode nav piemērota RNS izdalīšanai ne no upenēm, ne vērenēm, ne jāņogām. Paralēli tika izmēģināti trīs komerciāli RNS izdalīšanas komplekti, kas tika modificēti pēc literatūrā pieejamajiem datiem, lizēšanas šķīdumam pievienojot polivinilpirolidonu. Paraugu sagraušanai tika izmēģināta metode ar lizēšanas matriksiem A, D un E. Tika secināts, ka lizēšanas matriksi ir piemēroti augu paraugu sagraušanai un divi no trim izmantotajiem komplektiem ir savietojami ar šo metodi. Ieviestā modifikācija ļauj izdalīt RNS no upenēm, kur RNS tīrības rādītājs pie 260/280 nm ir 2.02 – 2.05. Papildus ir uzsākts izdalīto RNS paraugu kvalitātes un integritātes analīze uz Bioanalizātora.

Informācija publicēta 30.08.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. septembris - 2019. gada 30. novembris

Darbības Nr.1 ietvaros turpināta pumpurērču DNS multiplex PCR amplifikācija, PCR produktu sagatavošana sugu noteikšanai ar fragmentu garumu analīzi (FGA) uz ģenētiskā analizatora. Veikta PCR fragmentu garumu analīze 725 sagatavotajiem pumpurērču DNS multipleksa PCR paraugiem uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl sugu noteikšanai, papildus tika izveidots automatizēts analīzes protokols alēļu identifikācijai un atlasei. Veikta sākotnējā FGA datu analīze un noteiktas pumpurērču sugas ievāktajā materiālā. Turpināta nedestruktīvās elektronu mikroskopijas veidu un parametru piemērotības pārbaude pumpurērču sugu noteikšanai, tālākai nukleīnskābju izdalīšanai no vienas ērces un ērču sugas un BRV noteikšanai, kā rezultātā izstrādāti optimālākie pielietojuma protokoli. Turpināta BRV RNS izdalīšanas un noteikšanas ar PCR metožu pārbaude un izvērtēšana, kā rezultātā izstrādāts optimālākais pielietojuma protokols tālākam darbam. Veikts teorētiskais darbs pie metodikas izstrādes pumpurērču ITS/5.8S reģiona amplifikācijai un klonēšanai, uzsākta pielietojuma protokolu praktiskā pārbaude laboratorijā.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināta Ribes augu Ce un P rezistences gēnu identifikācijas metožu pilnveidošana iepriekšējos projekta posmos atlasītajā Ribes augu materiālā, kā arī iesaistot papildu Ribes paraugus. Turpināta molekulāro marķieru reakcijas apstākļu modificēšana stabilas gēniem specifisko fragmentu amplifikācijas nodrošināšanai. Atbilstoši projekta uzdevumiem, uzsākta esošās Ribes ģenētisko resursu ģenētiskās raksturošanas informācijas atlase un apkopošana, esošo genotipēšanas datu izvērtēšana publikācijas manuskripta sagatavošanai. Iegūtā informācija nodrošinās zināšanas par ģenētisko resursu daudzveidību un savstarpējo radniecību. Esošo ģenētisko datu papildināšanai, pārskata periodā veikta zinātniskās literatūras izpēte un molekulāro marķieru (cpSSR jeb hloroplastu mikrosatelītu) atlase Ribes augu materiāla starpsugu krustojumu struktūras skaidrošanai, ņemot vērā Ribes kultivēto augu, sevišķi upeņu sarežģīto izcelsmi un dažādu sugu iesaisti selekcijā, kas var ietekmēt to rezistenci. Projekta partneris BMC darbības Nr.2 ietvaros turpināja kopējās RNS izdalīšanas optimizācijas eksperimentus no iepriekš ievāktajiem Ribes ģints sugu genotipu lapu paraugiem (upeņu šķirne ‘Mara Eglite’, jāņogu šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’) un vērenes Ribes alpinum savvaļā ievākts genotips), kā arī veica izdalītās RNS, koncentrācijas, kvalitātes un integritātes (RIN) analīzi. Salīdzinot izdalītās RNS koncentrāciju, kvalitāti un RIN dažādos apstākļos uzglabātajiem paraugiem, tika secināts, ka no RNAlater uzglabātajiem paraugiem pie +4°C un -20°C izdalītā RNS ir gan ar augstāku koncentrāciju, gan RIN, kas ir būtiski kvalitatīvas NGS bibliotēkas sagatavošanā. Savukārt pie -80°C uzglabātajiem paraugiem tika novērots pretējs efekts. Līdz ar to RNAlater ir izmantojams augu paraugu uzglabāšanai pie augstākām temperatūrām. Izstrādātas optimālākās RNS izolēšanas metodes no Ribes ģints augu paraugiem – atlasot katram ģints sugas pārstāvim piemērotāko lizēšanas matriksu, optimālāko PVP koncentrāciju un izdalīšanas komplektu. Optimizētie RNS izdalīšanas apstākļi tiks izmantoti invadēto paraugu RNS izdalīšanai NGS bibliotēku sagatavošanai. Turpināta esošo zināšanu apkopošana par Ribes/Cecidophyopsis/BRV savstarpējo mijiedarbību, apkopojot gan literatūrā publicēto zinātnisko informāciju, gan agrāk iegūtos novērojumu rezultātus Ribes kolekciju izvērtēšanā DI un uzsākta apkopojoša raksta sagatavošana. Turpināta datu uzskaite un genotipu aprakstīšana pēc RIBESCO deskriptoriem Ribes ģenētisko resursu DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē, lai varētu atlasīt vērtīgākos genotipus iekļaušanai nacionālajā ģenētisko resursu saglabāšanas datu bāzē un starptautiskajās datubāzēs. Uzsākta datu apkopošana par 2019. gada sezonu. Turpināts darbs pie novērtēšanas metožu pilnveides sadarbībā ar virusoloģijas un entomoloģijas speciālistiem. Veikta rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo un izvēlēto vērtīgāko vietējās izcelsmes genotipu pavairošana un uzturēšana in vitro. Par projekta norisi un sasniedzamajiem rezultātiem informēti interesenti Eiropas zinātnieku nakts ietvaros, kur DI Augu patoloģijas un entomoloģijas laboratorijās populārzinātniskā veidā stāstīts par Cecidophyopsis pumpurērcēm, upeņu reversijas vīrusu un Ribes ģints augiem, tika rādīta plakāta prezentācija, kā arī tika nodrošinātas praktiskas demonstrācijas ērču iepazīšanai. Informācija par informatīvajām aktivitātēm publicēta DI Facebook vietnē.

Informācija publicēta 29.11.2019.

 



Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".