Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Ribes ģints augu, Cecidophyopsis pumpurērču un upeņu reversijas vīrusa izpēte ilgtspējīgai Ribes ģints ogulāju rezistences selekcijai un audzēšanai

 

 

Projekta nosaukums:Ribes ģints augu, Cecidophyopsis pumpurērču un upeņu reversijas vīrusa izpēte ilgtspējīgai Ribes ģints ogulāju rezistences selekcijai un audzēšanai”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma "Praktiskas ievirzes pētījumi" 2. kārtas ietvaros.

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/18/A/026

Projekta izpildes termiņš: 2019. gada 1. marts – 2022. gada 28. februāris

Projekta kopējais finansējums: 522 994,99 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Ph.D. Inga Moročko-Bičevska (Dārzkopības institūts)

Projekta partneris: Dr. biol. Ina Baļķe (Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs)

 

Projekta kopsavilkums:

Jāņogu ģints Ribes augu audzēšanu būtiski ietekmē Cecidophyopsis ērces un upeņu reversijas vīruss (BRV). Selekcijas programmas koncentrējas tikai uz C. ribis un diviem rezistences gēniem. Pētījumi parāda, ka arī citas Cecidophyopsis sugas ir plaši izplatītas, tā izskaidrojot atklātās saimniekaugu rezistences pretrunas.

Projekta mērķis ir skaidrot Cecidophyopsis-BRV kompleksa mijiedarbību ar Ribes augiem: 1) izpētot Cecidophyopsis sugu koncepciju un ģenētisko daudzveidību; 2) nosakot Cecidophyopsis sugu lomu BRV pārnesē; 3) raksturojot rezistences reakcijas uz Cecidophyopsis un BRV, izmantojot NGS gēnu ekspresijas un transkriptu analīzē; 4) izvērtējot un inventarizējot vietējo Ribes genofondu. Iegūtās zināšanas, izvērtētais vietējais genofonds un vietējo genotipu vīrusbrīvā in vitro kolekcija kalpos par bāzi ilgtspējīgai Ribes augu rezistences selekcijai un audzēšanai, sekmējot uz zināšanām balstītu bioekonomiku.

Projekta īstenošana sniegs jaunas zināšanas ilgtspējīgai Ribes augu rezistences selekcijai un audzēšanai, reizē palielinot zinātnisko publikāciju skaitu starptautiski recenzētos žurnālos un attīstot zinātnisko kapacitāti lauksaimniecībā un biotehnoloģijā. Izpildītāji ir valsts pētniecības institūti, kas garantē rezultātu publisku pieejamību (zinātniskās publikācijas, ziņojumi zinātniskās konferencēs) un zināšanu izplatīšanu nozarei (populārzinātniskās publikācijas, prezentācijas semināros, informācija publiskās datubāzēs). Projekts nodrošinās turpinājumu iesāktiem pētījumiem par Cecidophyopsis ērcēm un BRV, un, sadarbojoties abām institūcijām, uzsāktos progresīvos pētījumus augu ģenētikā, patoloģijā, molekulārajā bioloģijā un vides paraugu metagenomiskajā analīzē, nodrošinot pamatu recenzēto publikāciju sagatavošanai.

Informācija publicēta 01.03.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. marts - 2019. gada 31. maijs

Pētījumu īstenošana

Pārskata perioda laikā Darbības Nr.1 ietvaros noorganizētas piecas ekspedīcijas un ievākti paraugi pētījumiem Latvijā, Polijā, Lietuvā, Somijā, kopumā ievācot 134 Ribes augu paraugus.

Veikta mikroskopija un ērču klātbūtnes pārbaude pumpuros un sagatavoti paraugi DNS izdalīšanai. Veikta metodes izstrāde DNS parauga iegūšanai no viena ērces indivīda, kopumā analīzēm sagatavojot 919 pumpurērču DNS paraugus. Veikts darbs pie ITS reģiona amplifikācijas praimeru specifiskuma uzlabošanas, izstrādājot un testējot jaunizveidoto praimeru pārus. Uzsākta dažādu mikroskopijas veidu praktiska testēšana ērču paraugu nedestruktīvai analīzei un sugu noteikšanai, un tālākai DNS un RNS izdalīšanai no viena ērces indivīda. Uzsākta informācijas un pieejamo protokolu izpēte piemērotākās metodes izvēlei vīrusa RNS izdalīšanai no viena ērces indivīda.

Darbības Nr.2 ietvaros veikta publicētās informācijas atjaunināšana par Ribes augu rezistenci pret Cecidophyopsis sugām, zinātniskās literatūras analīze. Apkopota un analizēta informācija par iepriekšējos pētījumos analizētajiem Ribes augu paraugiem, Ce gēna genotipēšanas rezultātiem. Novērtēta DI esošā Ribes augu DNS kolekcija, tajā pieejamie paraugi, to raksturošanas pakāpe, uzsākta paraugu DNS kvantitātes un kvalitātes novērtēšana. Novērtēta DI esošā Ribes augu materiāla kolekcija DNS izdalīšanai.

Veikta padziļināta literatūras izpēte augstas kvalitātes kopējās RNS izdalīšanai no augu materiāla ar augstu polifenolu, polisaharīdu un antioksidantu saturu. Apkopotas izmantotās metodes. Izveidots protokola plāns kopējās RNS izdalīšanas metožu pārbaudei, piemērotākās identifikācijai. Veikta BMC pieejamo NGS sekvenēšanas platformu (Ion Torrent, Illumina un MGI) salīdzināšana. Ierīkots invadēšanas izmēģinājums NGS pētījumu vajadzībām uz podos audzētām āra apstākļos upenēm, jāņogām, vērenēm, invadējot tās ar trīs dažādām ērču sugām. Veikta invadēto paraugu pārbaude uz ērču bojājumiem un ievākti paraugi BRV diagnostikai pirms invadēšanas, lai izslēgtu iespējamo augu inficēšanos pirms invadēšanas. Ievākti un sagatavoti eksperimentālie Ribes augu paraugi no invadētajiem augiem RNS izdalīšanas metodikas optimizācijai, sagatavošanai NGS analīzēm.

Uzsākta sākotnēja vietējā genofonda izvērtēšana, apkopojot datus par agrākiem izvērtēšanas rezultātiem Ribes augu izturībā pret Cecidophyopsis ērcēm Dārzkopības institūta (DI) kolekciju stādījumos un izmēģinājumos. Apkopota esošā Ribes ģenētisko resursu fenotipiskās raksturošanas informācija, veikta datu statistiskā analīze. Sagatavots publikācijas manuskripts "Phenotypical variability and diversity within Ribes genetic resources collection of Latvia" un iesniegts publicēšanai Acta Horticulturae. Balstoties uz esošo informāciju par Ribes ģenētisko resursu fenotipisko raksturošanu, sagatavots mutisks ziņojums "XII International Rubus and Ribes Symposium: Innovative Rubus and Ribes Production for High Quality Berries in Changing Environments", 2019.gada 25.-28. jūnijā, Cīrihē. Uzsākta vietējās izcelsmes Ribes ģenētisko resursu kolekciju materiāla inventarizācija DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē, kā arī līdz šim ievākto datu inventarizācija, lai varētu izvērtēt, kādi papildus novērojumi un datu uzskaite būtu nepieciešami, lai atlasītu genotipus iekļaušanai nacionālajā ģenētisko resursu saglabāšanas datu bāzē un starptautiskajās datubāzēs.

Uzsākta līdz šim pilnvērtīgi neizvērtēto genofonda kolekcijās saglabāto un agrākajās genofonda ekspedīcijās ievākto vietējo Ribes genotipu izvērtēšana lauka kolekcijās. Vērtēšana veikta pēc RIBESCO deskriptoriem. Kopā uzsākta 23 ērkšķogu, 23 upeņu un 12 jāņogu genotipu vērtēšana.

Izveidots rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo genotipu saraksts pavairošanai in vitro un uzsākta šo augu ievadīšana in vitro, kā arī uzsākta vērtīgāko vietējās izcelsmes genotipu ievadīšana audu kultūrā atveseļošanai un tālākai saglabāšanai, veidojot atveseļotu, vīrusbrīvu kolekciju.

Informācija publicēta 31.05.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. jūnijs - 2019. gada 31. augusts

Darbības Nr.2 ietvaros veikta trīs Ribes ģints augu (upenes, vērenes, jāņogas) paraugu ievākšana un uzglabāšana pie dažādām temperatūrām (+4°C, -20°C, -80°C) ar un bez RNAlater, ar mērķi noteikt efektīvākos paraugu uzglabāšanas apstākļus, kas ļautu izdalīt kvalitatīvu kopējo RNS NGS analīzei. Pie +4°C uzglabātie paraugi ar un bez RNAlater tika izmantoti RNS izdalīšanai ar TRI Reagent, taču pēc RNS paraugu analīzes tika konstatēts, ka šī metode nav piemērota RNS izdalīšanai ne no upenēm, ne vērenēm, ne jāņogām. Paralēli tika izmēģināti trīs komerciāli RNS izdalīšanas komplekti, kas tika modificēti pēc literatūrā pieejamajiem datiem, lizēšanas šķīdumam pievienojot polivinilpirolidonu. Paraugu sagraušanai tika izmēģināta metode ar lizēšanas matriksiem A, D un E. Tika secināts, ka lizēšanas matriksi ir piemēroti augu paraugu sagraušanai un divi no trim izmantotajiem komplektiem ir savietojami ar šo metodi. Ieviestā modifikācija ļauj izdalīt RNS no upenēm, kur RNS tīrības rādītājs pie 260/280 nm ir 2.02 – 2.05. Papildus ir uzsākts izdalīto RNS paraugu kvalitātes un integritātes analīze uz Bioanalizātora.

Informācija publicēta 30.08.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. septembris - 2019. gada 30. novembris

Darbības Nr.1 ietvaros turpināta pumpurērču DNS multiplex PCR amplifikācija, PCR produktu sagatavošana sugu noteikšanai ar fragmentu garumu analīzi (FGA) uz ģenētiskā analizatora. Veikta PCR fragmentu garumu analīze 725 sagatavotajiem pumpurērču DNS multipleksa PCR paraugiem uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl sugu noteikšanai, papildus tika izveidots automatizēts analīzes protokols alēļu identifikācijai un atlasei. Veikta sākotnējā FGA datu analīze un noteiktas pumpurērču sugas ievāktajā materiālā. Turpināta nedestruktīvās elektronu mikroskopijas veidu un parametru piemērotības pārbaude pumpurērču sugu noteikšanai, tālākai nukleīnskābju izdalīšanai no vienas ērces un ērču sugas un BRV noteikšanai, kā rezultātā izstrādāti optimālākie pielietojuma protokoli. Turpināta BRV RNS izdalīšanas un noteikšanas ar PCR metožu pārbaude un izvērtēšana, kā rezultātā izstrādāts optimālākais pielietojuma protokols tālākam darbam. Veikts teorētiskais darbs pie metodikas izstrādes pumpurērču ITS/5.8S reģiona amplifikācijai un klonēšanai, uzsākta pielietojuma protokolu praktiskā pārbaude laboratorijā.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināta Ribes augu Ce un P rezistences gēnu identifikācijas metožu pilnveidošana iepriekšējos projekta posmos atlasītajā Ribes augu materiālā, kā arī iesaistot papildu Ribes paraugus. Turpināta molekulāro marķieru reakcijas apstākļu modificēšana stabilas gēniem specifisko fragmentu amplifikācijas nodrošināšanai. Atbilstoši projekta uzdevumiem, uzsākta esošās Ribes ģenētisko resursu ģenētiskās raksturošanas informācijas atlase un apkopošana, esošo genotipēšanas datu izvērtēšana publikācijas manuskripta sagatavošanai. Iegūtā informācija nodrošinās zināšanas par ģenētisko resursu daudzveidību un savstarpējo radniecību. Esošo ģenētisko datu papildināšanai, pārskata periodā veikta zinātniskās literatūras izpēte un molekulāro marķieru (cpSSR jeb hloroplastu mikrosatelītu) atlase Ribes augu materiāla starpsugu krustojumu struktūras skaidrošanai, ņemot vērā Ribes kultivēto augu, sevišķi upeņu sarežģīto izcelsmi un dažādu sugu iesaisti selekcijā, kas var ietekmēt to rezistenci. Projekta partneris BMC darbības Nr.2 ietvaros turpināja kopējās RNS izdalīšanas optimizācijas eksperimentus no iepriekš ievāktajiem Ribes ģints sugu genotipu lapu paraugiem (upeņu šķirne ‘Mara Eglite’, jāņogu šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’) un vērenes Ribes alpinum savvaļā ievākts genotips), kā arī veica izdalītās RNS, koncentrācijas, kvalitātes un integritātes (RIN) analīzi. Salīdzinot izdalītās RNS koncentrāciju, kvalitāti un RIN dažādos apstākļos uzglabātajiem paraugiem, tika secināts, ka no RNAlater uzglabātajiem paraugiem pie +4°C un -20°C izdalītā RNS ir gan ar augstāku koncentrāciju, gan RIN, kas ir būtiski kvalitatīvas NGS bibliotēkas sagatavošanā. Savukārt pie -80°C uzglabātajiem paraugiem tika novērots pretējs efekts. Līdz ar to RNAlater ir izmantojams augu paraugu uzglabāšanai pie augstākām temperatūrām. Izstrādātas optimālākās RNS izolēšanas metodes no Ribes ģints augu paraugiem – atlasot katram ģints sugas pārstāvim piemērotāko lizēšanas matriksu, optimālāko PVP koncentrāciju un izdalīšanas komplektu. Optimizētie RNS izdalīšanas apstākļi tiks izmantoti invadēto paraugu RNS izdalīšanai NGS bibliotēku sagatavošanai. Turpināta esošo zināšanu apkopošana par Ribes/Cecidophyopsis/BRV savstarpējo mijiedarbību, apkopojot gan literatūrā publicēto zinātnisko informāciju, gan agrāk iegūtos novērojumu rezultātus Ribes kolekciju izvērtēšanā DI un uzsākta apkopojoša raksta sagatavošana. Turpināta datu uzskaite un genotipu aprakstīšana pēc RIBESCO deskriptoriem Ribes ģenētisko resursu DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē, lai varētu atlasīt vērtīgākos genotipus iekļaušanai nacionālajā ģenētisko resursu saglabāšanas datu bāzē un starptautiskajās datubāzēs. Uzsākta datu apkopošana par 2019. gada sezonu. Turpināts darbs pie novērtēšanas metožu pilnveides sadarbībā ar virusoloģijas un entomoloģijas speciālistiem. Veikta rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo un izvēlēto vērtīgāko vietējās izcelsmes genotipu pavairošana un uzturēšana in vitro. Par projekta norisi un sasniedzamajiem rezultātiem informēti interesenti Eiropas zinātnieku nakts ietvaros, kur DI Augu patoloģijas un entomoloģijas laboratorijās populārzinātniskā veidā stāstīts par Cecidophyopsis pumpurērcēm, upeņu reversijas vīrusu un Ribes ģints augiem, tika rādīta plakāta prezentācija, kā arī tika nodrošinātas praktiskas demonstrācijas ērču iepazīšanai. Informācija par informatīvajām aktivitātēm publicēta DI Facebook vietnē.

Informācija publicēta 29.11.2019.

 

Projekta progress:

2019. gada 1. decembris - 2020.gada 29.februāris

Darbības Nr.1 ietvaros izstrādāti pielietojuma protokoli pumpurērču ITS/5.8S reģiona amplifikācijai un klonēšanai, veikta pirmo paraugu klonēšana, paraugu sagatavošana sekvencēšanai un nodoti pirmie paraugi projekta partnerim sekvencēšanai. Uzsākta pumpurērču morfoloģijas izpēte, izmantojot nedestruktīvu elektronmikroskopiju, veikta nukleīnskābju izdalīšana no vienas ērces indivīda un ērču sugas un BRV noteikšanai. Uzsākta BRV noteikšana vienas ērces indivīdā pēc elektronmikroskopijas.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināta Ribes augu Ce un P rezistences gēnu identifikācijas metožu pilnveidošana iepriekšējos projekta posmos atlasītajā Ribes augu materiālā, kā arī iesaistot papildu Ribes paraugus. Sagatavots materiāls Ce gēnam specifiskā amplifikācijas fragmenta klonēšanai, veikta klonēšana, sagatavoti un nodoti pirmie paraugi sekvencēšanai projekta partnerim BMC. Turpināts darbs pie esošās Ribes ģenētisko resursu genotipēšanas informācijas analīzes publikācijas manuskripta sagatavošanai. Uzsākta iepriekšējā atskaites periodā atlasītās hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR jeb hloroplastu mikrosatelītu) kopas pielietošanas metodikas adaptācija, piemērotāko marķieru atlase Ribes augu materiāla starpsugu krustojumu struktūras skaidrošanai. Projekta partneris BMC darbības Nr.2 ietvaros uzsācis kopējās RNS izdalīšanu no maijā un augustā ievāktajiem un pie -80°C uzglabātajiem upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) invadētajiem un kontroles paraugiem pēc iepriekš optimizētā RNS izdalīšanas protokola. Uzsākts darbs pie NGS bibliotēku sagatavošanas sekvencēšanai uz MGISeq2000.

Turpināta datu uzskaite un genotipu aprakstīšana pēc RIBESCO deskriptoriem Ribes ģenētisko resursu DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē, lai varētu atlasīt vērtīgākos genotipus iekļaušanai nacionālajā ģenētisko resursu saglabāšanas datu bāzē un starptautiskajās datubāzēs. Turpināta vērtēšanas datu apkopošana par 2019. gada sezonu. Veikts pumpurērces bojājumu intensitātes vērtējums Ribes DI lauka kolekcijās Dobelē un Pūrē. Turpināts darbs pie novērtēšanas metožu pilnveides. Audu kultūru laboratorijā turpināta rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo un vērtīgāko vietējās izcelsmes genotipu pavairošana un uzturēšana in vitro.

Turpināts darbs pie informācijas apkopošanas un apskata raksta sagatavošanas par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem. Par projekta norisi, un sasniedzamajiem rezultātiem informēti interesenti zinātniski praktiskajā konferencē “Līdzsvarota Lauksaimniecība”, kur Dārzkopības institūta zinātnieki prezentēja stenda ziņojumu, kā arī iesniedza publikāciju publicēšanai konferences rakstu krājumā.

Informācija publicēta 28.02.2020.

 

Projekta progress:

2020. gada 1. marts – 2020. 31. maijs

Darbības Nr.1 ietvaros turpināta pumpurērču ITS/5.8S reģiona PCR amplifikācija, klonēšana un paraugu sagatavošana sekvencēšanai. BMC veikta nodoto pumpurērču ITS/5.8S reģiona sekvencēšana ar Sangera metodi. No Apvienotās Karalistes saņemti papildu upeņu paraugi ar pumpurērcēm, no kurām izdalīta DNS un sagatavoti paraugi fragmentu garuma analīzei. BMC veikta PCR fragmentu garumu analīze jauniem pumpurērču DNS multipleksa PCR paraugiem uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl sugu noteikšanai, izmantojot iepriekš izveidoto, automatizētās analīzes protokolu. Turpināta BRV noteikšana vienas ērces indivīdā pēc elektronu mikroskopijas. Veikta iegūto sekvenču asemblija un uzsākta sekvenču un FGA datu sākotnējā analīze.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināts darbs pie informācijas apkopošanas un apskata raksta sagatavošanas par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem. Turpināta esošās Ribes ģenētisko resursu genotipēšanas informācijas analīze publikācijas manuskripta sagatavošanai, veicot papildu literatūras un datu analīzi.

Veikta iepriekšējos projekta posmos atlasīto hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR) pielietošanas metodikas adaptācija, izvēlēta informatīvāko marķieru kopa Ribes augu materiāla starpsugu krustojumu struktūras skaidrošanai. Izmantojot esošo Ribes paraugu kolekciju, veikta DNS izdalīšana. Ribes sugu pārstāvniecības nodrošināšanai veikta papildus paraugu ievākšana DI kolekcijā un to DNS izdalīšana un kvalitātes novērtēšana. Veikta PCR rezistences Ce gēnam specifisko amplifikācijas fragmentu iegūšanai to tālākai klonēšanai un sekvencēšanai. BMC veikta vadošā partnera nodoto Ce gēnu klonēto amplifikācijas fragmentu paraugu sekvencēšana ar Sangera metodi. Uzsākta iegūto sekvenču analīze.

Turpināts darbs pie upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēku sagatavošanas sekvencēšanai uz MGISeq2000, kā arī uzsākts darbs pie kopējās RNS izdalīšanas no maijā un augustā ievāktajiem un pie -80°C uzglabātajiem vēreņu (Ribes alpinum) un jāņogu (šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’)) invadētajiem un kontroles paraugiem pēc iepriekš optimizētajiem RNS izdalīšanas protokoliem un uzsākts darbs pie NGS bibliotēku sagatavošanas.

Izpētīta zinātniskā literatūra, izvēlēti un izstrādāti praimeri COX1, TEF 1-a, HSP70 gēnu fragmentu amplifikācijai pumpurērču sugu diagnostikas metodes izstrādei.

Turpināta Ribes ģenētisko resursu lauka kolekciju vērtēšana, veicot aprakstīšanu pēc RIBESCO deskriptoriem. Ievākta otrā gada datu kopa par augu fenoloģisko un veģetatīvo attīstību, ziedēšanu, izturību pret salnām. Kolekcijās Pūrē un Dobelē veikta BRV izplatības un simptomu vērtēšana. Ievākti paraugi jāņogām BRV noteikšanai laboratorijā, lai varētu izstrādāt slimības vērtēšanas metodiku. Audu kultūru laboratorijā savairoti un apsakņoti substrātā 9 Ribes genotipi no dažādām sugām, kas tiks izmantoti laboratoriskiem rezistences pētījumiem, un 9 upeņu un 4 ērkšķogu genotipi atveseļotas genofonda kolekcijas veidošanai, kuri tiks pārbaudīti uz BRV klātbūtni. Paralēli visu genotipu paraugi visu laiku tiek uzturēti un saglabāti in vitro.

Informācija publicēta 29.05.2020.

 

Projekta progress

2020. gada 1. jūnijs – 2020. 31. augusts

Darbības Nr.1 ietvaros no Apvienotās Karalistes saņemtajiem paraugiem un paraugiem pēc elektronu mikroskopijas veikta ITS/5.8S PCR amplifikācija, klonēšana un sagatavošana sekvencēšanai. BMC veikta vadošā partnera nodoto jauno pumpurērču ITS/5.8S reģiona amplificēto un klonēto, paraugu sekvencēšana ar Sangera metodi. Veikta PCR fragmentu garumu analīze jauniem pumpurērču DNS multipleksa PCR paraugiem uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl sugu noteikšanai, izmantojot iepriekš izveidoto, automatizētās analīzes protokolu. Uzsākta iegūto sekvenču asemblija un veikta FGA datu sākotnējā analīze. Turpināta ērču morfoloģijas izpēte ar elektronu mikroskopiju un BRV noteikšana vienas ērces indivīdā pēc elektronu mikroskopijas un augu materiālā.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināts darbs pie apskata raksta sagatavošanas par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem.

Turpināts darbs pie rezistences Ce gēnam specifisko amplifikācijas fragmentu sekvenču analīzes. Sagatavots publikācijas melnraksts par līdzšinējo Ribes ģenētisko resursu SSR marķieru genotipēšanas rezultātiem, uzsākta melnraksta pilnveidošana, iesaistot dažādu projekta aktivitāšu ekspertus. Uzsākta iepriekšējos projekta posmos adaptēto hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR) pielietošana Ribes augu materiāla genotipēšanai ar mērķi skaidrot starpsugu krustojumu iespējamo sugu struktūru. CpSSR genotipēšana veikta 126 upeņu (tai skaitā upeņu selekcijā izmantoto Ribes sugu paraugi), 13 jāņogu, 3 ērkšķogu, 8 vēreņu un 10 citu Ribes sugu paraugiem. BMC uzsākta no vadošā partnera nodoto, iepriekšējos projekta posmos atlasīto, 23 hloroplastu molekulāro marķieru PCR fragmentu garumu analīze (3818 paraugi) uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl un automatizētas analīzes protokolu izveide.

Sagatavotas upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēkas sekvencēšanai uz MGISeq2000. Turpinās darbs pie no maijā ievākto un pie -80°C uzglabāto vēreņu (Ribes alpinum) un jāņogu (šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’)) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēku sagatavošanas. Uzsākta 2019. gadā invadēto augu izvērtēšana un BRV infekcijas diagnostika. Izvērtēti rezultāti pēc vienas sezonas. Izanalizēti trīs grupu augi (Upenes, vērenes un jāņogas), kuras eksperimenta sākumā tika invadētas ar pumpurērcēm no inficētiem upeņu zariem. Ierīkots jauns invadēšanas izmēģinājums, izmantojot dažādu Ribes sugu in-vitro pavairotus augus un pumpurērces no dažādiem saimniekaugiem.

Izstrādāti COX1, TEF 1-α, HSP70 gēnu fragmentu PCR amplifikācijas protokoli un uzsākta to pielietojuma praktiskā pārbaude ar iepriekšējā periodā izstrādātajiem praimeriem diagnostikas metodes izstrādei.

Turpināta Ribes ģenētisko resursu lauka kolekciju vērtēšana, veicot aprakstīšanu pēc RIBESCO deskriptoriem. Ievākta otrā gada datu kopa par genotipu ražību, ogu kvalitāti, izturību pret kaitēkļiem un slimībām veikta ogu fenotipiskā aprakstīšana un fotografēšana. Audu kultūru laboratorijā turpināta rūpnieciskiem pētījumiem nepieciešamo augu saglabāšana un pavairošana in vitro, kas ievadīti 2019. gadā, kā arī veikta pētījumiem nepieciešamo vēl 16 genotipu ievadīšana. Audu kultūru laboratorijā tiek turpināta 10 upeņu un 5 ērkšķogu genotipu uzturēšana in vitro Latvijas izcelsmes atveseļotas genofonda pamatkolekcijas veidošanai. Dotajiem genotipiem ievākti paraugi vīrusu klātbūtnes noteikšanai. 2020. gada vasarā in vitro vēl ievadīti Latvijas izcelsmes 4 jāņogu un 1 ērkšķogu genotips. Pavasarī izvērtētā jāņogu genofonda kolekcijas augi laboratoriski pārbaudīti uz BRV infekciju.

Informācija publicēta 31.08.2020

 

Projekta progress

2020. gada 1. septembris – 2020. gada 30. novembris

Darbības Nr.1 ietvaros pabeigta pumpurērču elektronu mikroskopija, attēlu iegūšana un morfoloģisko parametru dokumentēšana. Uzsākta iegūto morfoloģijas datu analīze. Veikta nukleīnskābju izdalīšana no ērču indivīdiem pēc elektronu mikroskopijas, multipleksa PCR amplifikācija sugu noteikšanai, ITS/5.8S/28S PCR amplifikācija un sagatavošana sekvencēšanai. BMC veikta PCR fragmentu garumu analīze multipleksa PCR paraugiem uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl sugu noteikšanai, izmantojot iepriekš izveidoto, automatizētās analīzes protokolu un veikta ITS/5.8S/28S sekvencēšana ar Sangera metodi. Veikta ITS/5.8S/28S sekvenču kvalitātes pārbaude un datu failu izveide tālākām analīzēm. Veikta visu atlasīto ērču paraugu COX1 PCR amplifikācija, sagatavošana sekvencēšanai un sekvencēšana BMC ar Sangera metodi. Uzsākta iegūto sekvenču kvalitātes pārbaude. Turpināta BRV noteikšana ērču indivīdu DNS/RNS paraugos, lai skaidrotu sugu iesaisti vīrusa pārnesē. Veikta BRV CP amplifikācijas praimeru teorētiskā izstrāde un to piemērotības praktiskā pārbaude.

Darbības Nr.2 ietvaros turpināts darbs pie apskata raksta sagatavošanas par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem, sagatavots raksta manuskripts iesniegšanai.

Darbības ietvaros turpināts darbs pie rezistences Ce gēnam specifisko amplifikācijas fragmentu sekvenču analīzes. Turpināts publikācijas melnraksta pilnveidošanas darbs par Ribes ģenētisko resursu SSR marķieru genotipēšanas rezultātiem, iesaistot dažādu projekta aktivitāšu ekspertus. Pabeigta hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR) genotipēšana Ribes augu materiālam ar mērķi skaidrot starpsugu krustojumu iespējamo sugu struktūru. Materiāla tālākā analīze veikta BMC, kur pabeigta 23 hloroplastu molekulāro marķieru PCR fragmentu garumu analīze (3818 paraugi) uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl un izveidoti automatizēti analīzes protokoli katram marķierim.

Sagatavotas maijā ievākto un pie -80°C uzglabāto vēreņu (Ribes alpinum) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēkas sekvencēšanai uz DNBSEQ-G400 (ieriekš MGISeq2000). Nosekvenētas sagatavotās 2019. gada maijā ievākto upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) invadēto un kontroles paraugu 12 NGS bibliotēkas un četras 2019. gada maijā ievākto vēreņu (Ribes alpinum) NGS bibliotēkas uz DNBSEQ-G400. Veikta primārā datu statistiskā analīze upeņu paraugu RNA-Seq datiem. Veicot gēnu transkripcijas satistisko analīzi, 1. inficēto augu grupā tika identificēti 573 gēnu transkripti, 2. inficēto augu grupā – 769 gēnu transkripti, bet 3. inficēto augu grupā – 574 gēnu transkripti. Lai atlasītu kandidātgēnus, logFC bāzes līnijas vērtība tika izvēlēta 3. Vadoties pēc šī kritērija 1. grupā ar paaugstinātu ekspresijas līmeni tika atlasīti 10 gēni (At3g45310, NPC1, GOLS2, CP, ZIP10, GOLS1, PPDK, GOLS4, PPD, STC), bet ar pazeminātu - trīs gēni (CHSA, CHS, CHS1), 2 .grupā paaugstināta ekspresija bija 14 gēniem (At3g45310, NPC1, GOLS2, CP, ZIP10, GOLS1, PPDK, GOLS4, PPD, O2390, PLT5, PDR1, CAX3, SIGE), bet pazemināta – pieciem (At1g48100, CHSA, CHS, SKU5, P14009), savukārt 3. grupai paaugstināta ekspresija bija 21 gēnam (Os08g0191100, At1g60710, At3g45310, O23920, MSRB1, LWD1, NPC1, GOLS2, NPF3.1, ABCC10, FDH1, PECS2.1, AND1, APX3, SCE1, ABCC3, PLT5, OPR11, CP, GOS2, UBC9), bet pazemināta 17 gēniem (At4g15545, matK, ndhI, psaJ, ndhE, psbK, psbW, ART2, cemA, RRT15, ndhG, PSBS2, CHS, RRF, ATP6, RPS17, PSRP3). Turpinās darbs pie no maijā ievākto un pie -80°C uzglabāto jāņogu (šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’)) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēku sagatavošanas.

Turpināts darbs pie izstrādāto TEF 1-a un HSP70 praimeru PCR amplifikācijas protokolu pielietojuma praktiskās pārbaudes un to piemērotības izvērtēšana Cecidophyopsis sugu diagnostikas metodes izstrādei.

Pārskatot un apkopojot informāciju par Ribes augu vietējiem ģenētiskajiem resursiem datu bāzēs un kolekcijās, sastādīts konsolidēts un atjaunināts Ribes ģenētisko resursu saraksts, kas iesniegts iekļaušanai valsts ģenētisko resursu sistēmā. Turpināta vietējo ģenētisko resursu izvērtēšana. Izveidota otrā gada datu kopa par nesen iegūto, vēl neizvērtēto vietējo Ribes genotipu izvērtēšanas rezultātiem. Turpināta ģenētiskajos resursos iekļauto genotipu aprakstīšana pēc RIBESCO deskriptoriem un uzsākta to aprakstīšana pēc EURISCO deskriptoriem. Izstrādāta uzlabota metodoloģija pumpurērču bojājumu intensitātes un reversijas vērtēšanai lauka apstākļos. Audu kultūru laboratorijā turpināta rūpnieciskiem pētījumiem un ģenētisko resursu kodolkolekcijas izveidošanai nepieciešamo augu saglabāšana un pavairošana in vitro.

Par projekta norisi, rezultātiem un vietējas izcelsmes Ribes ģenētiskajiem resursiem sagatavotas divas populārzinātniskas publikācijas:

1) Moročko-Bičevska I., Stalažs A., Lācis G., Laugale V. (2020) Ribes ģints augu, Cecidophyopsis pumpurērču un upeņu reversijas vīrusa izpēte ilgtspējīgai Ribes ģints ogulāju rezistences selekcijai un audzēšanai. Zinātniski praktiskās konferences “Līdzsvarota Lauksaimniecība” 20.02.2020., LLU, Jelgava, Latvija rakstu krājums, 120-122.

http://www.lf.llu.lv/sites/lf/files/2020-09/Latvia-lidzsvarota-lauksaimniec_rakstu_krajums_2020.pdf

2) Laugale V. (2020) Krūmogulāju ģenētiskie resursi Latvijā, to izpēte un saglabāšana. ‘’Profesionālā Dārzkopība’’ 3 (13): 20-24.

https://fruittechcentre.eu/sites/default/files/2020-11/Profesionala_DARZKOPIBA_13.pdf

Informācija publicēta 30.11.2020

 

Projekta īstenošanas progress (01.12.2020. – 28.02.2021.)

Darbības Nr.1 ietvaros turpināta pumpurērču elektronu mikroskopijas attēlu un morfoloģisko parametru datu sistematizēšana un uzsākta datu analīze. Turpināta iegūto ITS/5.8S/28S un COX1 sekvenču kvalitātes pārbaude un datu failu izveide tālākām analīzēm. Turpināta BRV noteikšana ērču indivīdu DNS/RNS paraugos, lai skaidrotu sugu iesaisti vīrusa pārnesē. Turpināta BRV CP amplifikācijas praimeru teorētiskā izstrāde un to piemērotības praktiskā pārbaude.

Darbības Nr.2 ietvaros noslēgts darbs pie apskata raksta sagatavošanas par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem, iesniegts apskata raksts žurnālā “Annals of Applied Biology”.

Turpināts darbs pie Ribes ģenētisko resursu SSR marķieru genotipēšanas rezultātu analīzes pilnveidošanas un publikācijas melnraksta papildināšanas. Uzsākta Ribes augu materiāla hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR) genotipēšanas datu analīze, marķieru pielietojamības novērtēšana ar mērķi skaidrot Ribes starpsugu krustojumu iespējamo sugu struktūru. Šīs darbības ietvaros turpināts darbs pie NGS datu analīzes un apstrādes. Darbs tika turpināts pie no 2019. gada maijā ievākto un pie -80°C uzglabāto jāņogu [šķirne ‘Kodu Suur Valge’ (‘Hele’)] un vēreņu (Ribes alpinum) invadēto un kontroles paraugu NGS bibliotēku sagatavošanas un sekvenēšanas. Pēc NGS trenskriptomas datu analīzes 2019. gada maijā ievākto upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) paraugos tika identificēts, līdz šim Latvijā neidentificēts vīruss, Upeņu asociētais rhabdovīruss 1 [Black currant-associated rhabdovirus 1 (BCaRV)]. Uz šo rezultātu pamata tika sagatavots raksta manuskripts iesniegšanai žurnālā “Plant Disease”, kā arī veikta vīrusa genoma sekvences ievietošana GenBank dautu bāzē.

Turpināts darbs pie izstrādāto TEF 1-a un HSP70 praimeru PCR amplifikācijas protokolu pielietojuma praktiskās pārbaudes un to piemērotības izvērtēšana Cecidophyopsis sugu diagnostikas metodes izstrādei. Uzsākts darbs pie COX1 sekvenču izvērtēšanas sugām specifisko praimeru izstrādei.

Turpināta vietējo ģenētisko resursu izvērtēšana un 2020. gadā iegūto datu analīze. Audu kultūru laboratorijā turpināta rūpnieciskiem pētījumiem un ģenētisko resursu kodolkolekcijas izveidošanai nepieciešamo augu saglabāšana un pavairošana in vitro, uzsākta vīrusu noteikšana augu materiālā un genotipu atveseļošanas efektivitātes pārbaude.

Informācija publicēta 26.02.2021

 

Projekta īstenošanas progress (01.03.2021. – 31.05.2021.)

Darbības Nr.1 ietvaros turpināta pumpurērču elektronu mikroskopijas attēlu un morfoloģisko parametru datu analīze. Uzsāktas ITS/5.8S/28S un COX1 sekvenču filoģenētiskās analīzes. Paralēli analizēta literatūra par iespēju izmantot ērču ģenitāliju morfoloģiju ģints ietvaros sugu atšķiršanai. Secināts, ka šīs pazīmes vairāk nozīmīgas ģinšu atšķiršanai, tāpēc nolemts tās tālāk neanalizēt, paliekot pie pazīmēm, kas sugu nošķiršanai ir izmantotas iepriekš.

Atkārtoti analizēti pozitīvie Ribes ģints augu paraugi ar praimeriem, kas ir specifiski vīrusa apvalka proteīna sekvencēm, lai veiktu paraugu atlasi BRV apvalka proteīna kodējošo sekvenču iegūšanai. Ar praimeriem P3233/P3643 amplificēts 410 bp fragmentu no BRV RNS2, kas noklāj BRV proteīna apvalka daļu no 3480 nt līdz 3643 nt. Pārējā BRV proteīna apvalka fragmenta daļa amplificēta ar praimeriem P3673/P5236, kas amplificē 1563 bp garu fragmentu. Sekvencēšanai izmantoti četri praimeru pāri, kas noklāj BRV proteīna apvalka kodējošo daļu no 3673 nt līdz 5046 nt. Kopā sekvencēšanai sagatavoti 26 paraugi no upenēm, jāņogām, ērkšķogām, vērenēm, īvēm, lazdām un ērkšķogu un upeņu hibrīdiem. BMC veikta šo paraugu sekvencēšana uz ģenētiskā analizatora ABI PRISM 3130xl. Uzsākta iegūto BRV sekvenču analīze un kvalitātes pārbaude.

Darbības Nr.2 ietvaros veikti labojumi pēc recenzentu norādēm apskata rakstā par šķirņu rezistences pret Cecidophyopsis un BRV un to savstarpējo mijiedarbību pētījumiem, iesniegta labotā apskata raksta versija žurnālā “Annals of Applied Biology”.

Pabeigts darbs pie pētījuma par Ribes ģenētisko resursu genotipēšanas analīzi, izmantojot SSR marķierus, raksts “Evaluation of blackcurrant (Ribes nigrum) germplasm structure by microsatellitebased fingerprinting for the diversification of the breeding material” (autori: Gunārs Lācis, Katrīna Kārkliņa, Irita Kota-Dombrovska, Sarmīte Strautiņa) akceptēts publicēšanai izdevumā “Journal of Berry Research” (https://www.iospress.nl/journal/journal-of-berry-research/). Turpināts darbs pie Ribes augu materiāla hloroplastu molekulāro marķieru (cpSSR) genotipēšanas datu analīzes, rezistences gēna P identifikācijas metodes izstrādes un NGS datu analīzes un apstrādes. Uzsākts darbs pie kopējās RNS izdalīšanas no 2019. gada augustā ievākto un pie -80°C uzglabāto upeņu (šķirne ‘Mara Eglite’) invadētajiem un kontroles paraugiem. Upeņu asociētā rhabdovīrusa 1 [Black currantassociated rhabdovirus 1 (BCaRV)] izolāta Māra Eglīte pilnā genoma sekvence tika ievietota European Nucleotide Archive datu bāzē ar identifikācijas numuru OU015520-OU015520. Sagatavotais raksta manuskripts “First report of black currant-associated rhabdovirus 1 in blackcurrants in Latvia” ir iesniegts žurnālā “Plant Disease”.

Turpināts darbs pie izstrādāto TEF 1-α un HSP70 praimeru PCR amplifikācijas protokolu pielietojuma praktiskās pārbaudes un to piemērotības izvērtēšana Cecidophyopsis sugu diagnostikas metodes izstrādei. Turpināts darbs pie COX1 sekvenču izvērtēšanas sugām specifisko praimeru izstrādei.

Aprīlī veikta invadēto pumpuru uzskaite dažādiem Ribes genotipiem rezistences novērtēšanas metodes pilnveidošanai, reģistrējot invadēto un veselo pumpuru skaitu pa augiem. Ierīkots jauns invadēšanas eksperiments ar mērķi pārbaudīt, vai no vienas augu grupas augiem ērces var invadēt citas augu grupas augus, tāpēc dažādu augu izcelsmes pumpurērces novietotas uz dažādu Ribes grupu in vitro pavairotiem augiem, tajā skaitā zelta jāņogām (Ribes aureum) un ērkšķogām, kurām Latvijā pumpurērces līdz šim nav konstatētas.

Turpināta Ribes ģenētisko resursu lauka kolekciju vērtēšana, veicot aprakstīšanu pēc RIBESCO deskriptoriem. Ievākta trešā gada datu kopa par augu fenoloģisko un veģetatīvo attīstību, ziedēšanu, izturību pret salnām. Kolekcijā Pūrē veikta BRV izplatības un simptomu vērtēšana. Par upeņu šķirņu šķirņu izturību pret pumpurērcēm sniegts ziņojums Dārzkopības institūta organizētajā informatīvajā dienā “Pavasaris 2021”, kurā prezentēti projekta gaitā apkopotie rezultāti. Kolekcijā Pūrē ievākti paraugi jāņogām BRV noteikšanai laboratorijā, lai varētu precizēt vizuālās slimības pazīmes. Audu kultūru laboratorijā laboratoriskiem rezistences pētījumiem savairoti 14 Ribes genotipi no dažādām sugām. Atveseļotas genofonda kolekcijas veidošanai, pašlaik in vitro ievadīti un tiek saglabāti un 9 upeņu, 2 jāņogu un 5 ērkšķogu genotipi. Upenēm un ērkšķogām laboratorijā veikta testēšana uz vīrusiem atveseļošanas efektivitātes noteikšanai.

Informācija publicēta 31.05.2021.



Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".